[00098707]重组胸腺素β4的研究与开发

　　重组胸腺素β4的研究与开发 　　军事医学科学院生物工程研究所 　　一、项目简介 　　1、胸腺素β4（Tβ4）介绍 　　胸腺素（Thymosins）是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，由Goldstein和White于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，是一组小分子多肽，含有40多种组分。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可以划分为α、β、γ三个型：PI(α)＜5，5＜PI（β）＜7，PI（γ）＞7。目前已经有20多种β胸腺肽异构体被鉴定出来，而人体内主要存在三种：Tβ4、Tβ10和Tβ15，其中Tβ4含量最高。Tβ4是由43个氨基酸组成，结构高度保守的水溶性多肽，N末端具有乙酰化修饰（Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQA GES），平均分子量为4964Da，等电点为5.1。 　　Tβ4被认为是主要的球形肌动蛋白（G-actin）结合肽，能与G-actin单体结合从而阻断其聚合。研究表明Tβ4是具有抗炎、促进创伤愈合的多肽，应用于皮肤创伤愈合、眼角膜损伤修复、干眼症治疗、心肌损伤修复、神经损伤修复以及化妆品领域。 　　2、Tβ4促进角膜损伤愈合的机制 　　图1 Tβ4促进角膜损伤愈合的机制 　　炎症反应是影响角膜修复的重要因素，急性炎症反应正是由于多形核白细胞（PMN）快速浸透角膜所致，并由此引发后续的慢性炎症。Sosne课题组研究发现，在角膜修复过程中用Tβ4处理伤口能显著降低炎症相关因子的表达水平，如IL-1β、巨噬细胞炎症蛋白MIP-1α、MIP-1β、MIP-2，单核细胞化学引诱蛋白-1（MCP-1）和角质化细胞趋化因子（KC），通过下调这些趋化因子来抑制PMN的渗透，进而达到抑制炎症的效果。最近，Sosne又发现了Tβ4抑制炎症的一种新途径，通过抑制NFκB的激活和磷酸化阻止其进入细胞核，使NFκB丧失了调控相关炎症蛋白的表达，从而抑制炎症。除此之外，Tβ4内化进细胞后其组氨酸残基被胞内的H2O2或氧自由基等氧化剂氧化成Tβ4氧化物，这种氧化物已经被证明是一种新的炎症抑制因子，这也是一种炎症抑制途径。 　　细胞凋亡是诸如干眼综合症、紫外照射和感染等引起的角膜创伤的病理机制，而死亡受体和线粒体途径介导的信号通路是导致细胞凋亡的主要途径。胱冬肽酶（caspase）是细胞凋亡级联反应中一类重要的酶，其中caspase 2，8，9和10被认为是凋亡起始者，caspase 3，6和7是执行者，起始者活化执行者。经Tβ4处理过的创伤人角膜上皮细胞（HCEC）的凋亡被显著降低，这主要是由于Tβ4抑制了四个起始者胱冬肽酶的活性，尤其是caspase 8的活性。研究发现Tβ4可以抑制FasL介导的caspase 8激活，并可以减少线粒体有害的结构变化和细胞色素C的释放，最终降低caspase 9的活性。此外，Tβ4还能提高Bcl2基因的表达，Bcl2是一种原癌基因，它能够延长细胞的存活，抑制细胞凋亡。Ho等人还发现H2O2诱导的凋亡细胞经Tβ4处理后超氧化物歧化酶（SOD）表达上调，SOD消除胞内氧自由基压力，抑制细胞凋亡。Tβ4是G-actin结合多肽，外源Tβ4顺利内化进HCEC对抑制其凋亡非常关键。有研究者发现细胞松弛素D能够阻止Tβ4的内化，这说明Tβ4的内化与胞内的细胞骨架结构密切相关，Tβ4可能正是利用它G-actin结合肽的性质来实现内化并最终实现抑制细胞凋亡的，但是Tβ4 抑制细胞凋亡的具体机制还需要进一步去研究和证实。 　　MMPs能够降解胞外基质（ECM），阻碍角膜修复，Tβ4能够下调HCEC中MMP-2、MMP-9以及MT6-MMP（membrane-type MMP）的表达，通过调控MMP/TIMP（金属蛋白酶组织抑制因子）的平衡来促进角膜修复和ECM重构，这种作用与皮肤创伤愈合中截然相反，说明Tβ4对MMPs的调控作用显然是细胞特异性的。研究还发现Tβ4能促进眼角膜上皮细胞形成，并能通过增加层粘连蛋白-5表达而促进角膜上皮细胞和结膜上皮细胞的迁移，但对细胞增殖却不起作用。Tβ4处理过的角膜间质水肿也显著降低，间质薄层的层次和上皮细胞连接的排列也更规则，细胞层间的空泡化程度也更低，这些作用都促进了角膜的修复。 　　总结，Tβ4治疗角膜损伤的机制如下： 　　1）Tβ4可以抑制炎症反应，促进角膜修复。 　　2）Tβ4可以抑制细胞凋亡，促进角膜修复。 　　3）Tβ4可以抑制MMPs表达，促进角膜修复。 　　4）Tβ4能促进眼角膜上皮细胞形成，促进角膜修复。 　　3、Tβ4的临床应用进展 　　雷根内克斯（RegeneRx）生物制药有限公司目前正在开发Tβ4药物。临床试验进展如下。 　　1）滴眼液：干眼症治疗，处于II期。神经营养性角膜炎，处于II期。 　　2）皮肤外用：压力性溃疡、静脉阻赛性溃疡，已完成II期。 　　3）注射剂：急性心梗引发的心肌损伤、多发性硬化症，已完成I期。 　　4）神经损伤修复。 　　4、生物合成方法规模化制备Tβ4 　　Tβ4由43个氨基酸组成，具有N末端乙酰化修饰的多肽。由于基因工程技术难以解决小分子多肽的表达以及N-末端乙酰化修饰难题，目前在临床研究中应用的为化学合成产品。多肽的化学合成，原料价格高，工艺复杂、收率低，而且合成过程中用到许多有毒物质，对环境污染较大。利用基因工程技术规模化制备胸腺素可以降低成本，减少污染。 　　本项目解决了生物合成胸腺素的两大难题：N-末端乙酰化修饰和高表达。具有以下技术特点。 　　1）利用优化Intein融合表达技术高效合成小分子多肽，避免酶法加工产生的二次污染和高成本。 　　图2 利用Intein介导切割技术制备多肽 　　2）利用改构的大肠杆菌宿主获得完全N-末端乙酰化修饰的胸腺素 　　本项目应用Red重组技术将特异的NAT整合到大肠杆菌染色体上，获得稳定表达NAT的宿主，然后将构建的高表达Intein融合蛋白质粒转入其中，得到高表达工程菌。应用高密度培养技术，经过纯化、切割、精细纯化，每升培养液可以获得纯度>98%的重组N-末端乙酰化胸腺素200mg，达到国际领先水平。已申请中国发明专利（申请号：201010521842.3）。 　　图3 高效生物合成胸腺素 　　应用我们的生产工艺，从每升发酵液中可以提取200mg纯品（纯度大于98%），其结构与化学合成的Tβ4完全一致，成本不到2元/mg。生产规模容易放大。 　　二、项目研究计划 　　我们已经完成的工作： 　　1、采用代谢工程和合成生物学技术对大肠杆菌染色体进行改造，成功表达了具有N-末端乙酰化修饰的Tβ4。这是国际上首次实现大肠杆菌表达具有N-末端乙酰化修饰的Tβ4。并已申请发明专利(方宏清，戴红梅，孙旭，任元涛，司信喜，李树龙，陈惠鹏，周长林。N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌。申请日：2010年10月21日。申请号：201010521842.3。) 　　2、在实验室规模完成了工程菌的初步发酵培养及初步纯化，并鉴定其N-末端丝氨酸被乙酰化，N-端序列分析、质谱分子量与理论值一致，确定重组Tβ4的结构与天然Tβ4一致，获得了具有天然结构的rhT?4。 　　3、进行了T?4纯度、内毒素含量和宿主蛋白残留测定。符合生物制品规程要求。 　　4、开展T?4的滴眼液制剂，用于干眼症等治疗。 　　三、合作模式 　　前期补偿，后期技术占股的方式。具体补偿金额及占股比例双方协商。 　　四、市场前景及风险分析 　　Tβ4的市场应用潜力巨大。 　　由于机算机、空调的普及，人们视频工作时间过长，环境污染,配带角膜接触镜，角膜屈光手术及内眼手术的发展，干眼症的发病率逐年增高,并有年轻化的趋势。据调查，干眼症的发病率为28.7%，其中女性发病率33%，男性发病率22%，严重干眼症16%，角膜接触镜配戴者的发病率(50.1%)明显高于非角膜接触镜配戴者(21.7%)。 　　干眼症,又称角结膜干燥症，是指各种原因引起的泪液质和量或动力学的异常,常导致泪膜不稳定和眼表面组织病变，并伴有眼部不适症状为特征的一类疾病的总称。现有的治疗干眼症的方法主要是人工泪液替代疗法，但是多数人工泪液均含有防腐剂，而防腐剂又是诱发干眼症的原因之一。此外，人工泪液与眼泪毕竟还是存在区别，很难避免不会对眼睛造成刺激。干眼症治疗药物已成为药物研究热点之一，市场潜力有几百亿元。 　　Tβ4具有能促进眼睛退化的逆转或抑制眼睛退化，例如干眼综合症所导致的眼睛退化。可能的临床应用可包括由于发炎病症而引起的疾病，如干眼、葡萄膜炎、虹膜炎、白内障手术后发炎、激光原位角膜磨镶术（LASIK）或激光屈光性角膜切削术（PRK）。因此，Tβ4的未来市场应用前景诱人。 　　本项目采用拥有自主知识产权的、国际先进的生物合成技术，降低了生产成本，且更容易放大生产规模，处于国际领先水平。已申请发明专利。未来将具有很强的竞争力。 　　五、技术完成单位 　　该项技术承蒙国家自然科学基金资助，由军事医学科学院生物工程研究所完成，该所长期从事生物技术药物开发研究，先后完成了霍乱毒素B亚单位工程菌复合苗、rhIL-2、rhEPO、rhpro-UK等新药，并成功转让企业。项目负责人方宏清长期从事重组蛋白药物及合成生物学研究，曾获得国家科技进步二等奖1项，国家新药证书1项，参加研发的项目已成功转让企业并投入生产。