[00963399]松萎蔫病致病新理论及应用

项目背景：松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起一种松树毁灭性病害。已成为中国第一大森林病虫害。由于对萎蔫病的致病机制没有了解清楚，所以长期以来国内外对该病的控制仍处于十分被动的局面，防治技术的突破有赖于对松材线虫病致病机制研究上的突破。主要技术内容：自1996年以来，项目组先后依托国家自然基金、国家林业局、江苏省科委等9项国家和省部级科技项目，致力于松材线虫致病机理及其应用研究工作。1.通过对中国主要松材线虫病疫区的调查，鉴定出松材线虫携带的致病细菌的种类、优势种及其分布，测定了其致病性；发现了松材线虫与其携带的致病菌之间的互惠共生关系；首次提出并用下列实验验证了该病是松材线虫与其携带的致病菌共同引起的复合侵染这一假说。2.用电镜和光镜观察到松材线虫的体表携带了大量的细菌；测定了每条线虫的携菌量；从接种枝和非接种枝上首先分离到的主要是致病的假单胞菌；使用黑松愈伤组织、黑松的实验室、温室和林间接种试验均证明，松材线虫病的诱导必须由松材线虫与其携带的致病菌共同作用才能完成。3.试验证明，抗生素可以抑制松材线虫病，并对苦豆碱、α-三噻吩等杀线剂具有增效作用等。建立了细菌毒素的单细胞荧光生测方法，并成功都应用于跟踪细菌毒素的分离。发明了培养发育正常的无菌松材线虫的方法，获得国家发明专利。4.首次从荧光假单胞菌GcM5-1A菌株中得到了致病菌的鞭毛蛋白和两个环二肽毒素，并证明接种野生松材线虫的松树中存在这些毒素；免疫荧光分析等系列实验表明鞭毛蛋白作用在黑松细胞膜上，致使膜内电解质大量外渗，诱导寄主萎蔫；同时使胞内DNA与RNA降解、核变形、解体，细胞壁断裂，解释了寄主萎蔫和死亡的机理。将该鞭毛蛋白编码基因导入E.coli构建工程菌，无菌松材线虫+该工程菌的接种实验证明其诱导了黑松的萎蔫、死亡，结果证明该假说符合基因水平的科赫法则，将该假说证明为松萎蔫病致病新理论，并把松萎蔫病的致病机理的研究从经典病理学水平提高到分子病理学水平，为根治松萎蔫病奠定了理论基础。建立了利用监测病木中鞭毛蛋白的方法对患病松树进行早期诊断的新方法并获国家专利。5.发现了苦豆碱、α-三噻吩等天然化合物对松材线虫极强的杀线活性，并获国家专利，研究了其对松萎蔫病的防控机理，林间试验证明其与杀细菌剂联合应用对松萎蔫病的防效达98%以上，以上根据新理论建立的监测和防治新技术为拔除疫点和清除疫区提供了理论和物质基础。