[00885847]超声靶向微泡携基质金属蛋白酶抑制因子-1siRNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究

成果来源：河南省高校杰出科研人才创新工程，2006，KYCX006。技术原理及性能指标：1.应用RNAi技术，构建TIMP-1pRNAT-U6.2/LentisiRNA慢病毒真核表达载体并鉴定其体外对TIMP-1的沉默效应，为进一步观察其在体抑制TIMP-1基因表达，降解肝纤维化过度沉积胶原纤维制备应用工具。2.构建肝纤维化大鼠模型，观察大鼠肝纤维化过程中血清学及组织病理学，特别是肝组织内TIMP-1mRNA(原位杂交、双引物荧光定量RT-PCR)及蛋白(免疫组化)表达情况，奠定TIMP-1siRNA表达载体在体转染干扰肝纤维化进程的基础。3.TIMP-1siRNA表达载体经静脉注射，观察其在体内分布情况，肝组织内基因转染效率，基因抑制有效时间、稳定性及对血清学、肝组织生理病理学的影响。4.TIMP-1siRNA表达载体在超声造影剂微泡、超声辐照干预下在肝组织内转染效率，观察肝纤维化相关血清学指标(Elisa法TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ)，肝组织病理学改变及胶原纤维含量变化。该课题应用RNAi技术构建抑制TIMP-1的真核表达载体TIMP-1pRNAT-U6.2siRNA(TIMP-1siRNA)，并应用超声造影剂微泡技术携带TIMP-1siRNA转染肝纤维化大鼠，观察其对大鼠血清学、肝组织结构形态学的影响，为肝纤维化基因治疗提供高效、特异基因及安全、有效基因转载途径技术创造性与先进性：1.成功筛选构建了定点敲除TIMP-1的特异表达载体pRNAT-U6.2siRNA真核表达质粒及Lentivirus病毒包装的TIMP-1pRNAT-U6.2/LentisiRNA慢病毒表达载体。2.将TIMP-1pRNAT-U6.2siRNA质粒及TIMP-1pRNAT-U6.2siRNA/LentisiRNA慢病毒载体转染肝星形细胞(T6)，鉴定其对TIMP-1表达的沉默效应，TIMP-1基因447-470bp做为siRNA插入序列的表达载体沉默效应最显著。3.细胞外基质过度沉积是肝纤维化的基础，而基质金属蛋白酶及其抑制因子的调节失衡是核心，以往研究多在宏观调控核心的周围，针对核心中TIMP-1的抑制该研究应用基因抑制RNA干扰技术及pRNAT-U6.2/Lenti表达载体系统，首次将其应用在肝纤维化研究中，为肝纤维化基因治疗提供有效靶基因及工具。4.首次将TIMP-1小干扰RNA表达载体应用超声造影剂携带，在高机械指数超声辐照条件下探索将目的基因定向释放于靶器官肝组织的的方法，提高基因转染效率、减低基因对非目的器官干扰，为肝纤维化基因治疗提供高效、安全转运途径。以后工作方向：1.细化超声辐照的机械指数、时间与辐照方位微泡剂量的协调匹配，使表达载体转染效率更高、分布更均匀。2.改进载体包装，准确调控基因表达的启闭过程，争取为内脏器官纤维化问题提供适用依据。该研究在国家级核心期刊发表论文12篇，另有2篇正在Ultrasoundinmedicineandbiology和NatBiotechnol审稿，有10篇论文在各级学术会议及学习班等不同场合进行专题讲座、学术交流及推广，具有良好的社会及经济效益。河南省科技进步三等奖2项，河南省医药卫生科技成果一等奖1项，河南省高校杰出科研人才创新工程项目1项。