[00790993]水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建及遗传转化

水稻条纹叶枯病是水稻主要病害之一。由于条纹叶枯病的传毒媒介灰飞虱具有很强的迁飞习性，加之该病毒宿主范围广，所以化学药剂很难防治。传统的抗病育种方法又受到抗性资源的极大限制，无法适应病毒的快速变异。鉴于水稻条纹叶枯病毒序列和水稻基因组的测序工作已完成，该研究针对水稻条纹叶枯病毒基因序列设计RNA干扰序列，构建RNAi载体，利用农杆菌介导转化感病水稻品种，探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病，建立高效、持久、无公害的抗病毒体系，从根本上解决该病的危害。研究过程及主要研究结果如下：(1)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov查得水稻条纹叶枯病毒的4条RNA序列，分别以RNA1和RNA3链中的外壳蛋白(coatprotein)基因及RNA聚合酶(RNAPolymerase)基因的开放阅读框为目标链，利用siRNATargetFinder在线软件预测siRNA干扰片段，共获得168条。把这些片段在水稻基因组中BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)，获得与水稻基因组完全不匹配的干扰片段6条。依据干扰序列中碱基的GC含量在40%～50%活性较高的原则，最后确定2条干扰序列。(2)化学合成干扰序列，利用pCAMBIA1301质粒，采用酶切、连接等手段构建了RNA干扰载体pASV1301-1、pASV1301-2，采用冻融法将构建好的载体转到EHA105根癌农杆菌中，并用琼脂糖电泳检测。(3)研究了8个感水稻条纹叶枯病品种成熟胚诱导愈伤的差异，结果显示出愈率在67%～94%，90-3最高，为94%，确定用90-3作为转化受体材料。(4)优化了水稻愈伤再生体系。采用先把水稻愈伤放在滤纸上光照干燥培养2～3天，转到预分化培养基上暗培养一周，再转到分化培养基上培养。通过研究激素6-BA、NAA和KT的浓度配比，确定预分化培养基最适激素浓度为6-BA4mg/L、NAA0.5mg/L，分化培养基最适激素浓度为6-BA3mg/L、NAA0.5mg/L、KT1mg/L。(5)从水稻再生植株的叶片中提取总DNA，利用干扰序列合成的特异引物进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测，确定有23株水稻已经被成功转入了目的片段。近年来水稻条纹叶枯病在中国北方稻区大面积发生，特别是在冀、京、津、鲁、豫等地十分常见，给水稻生产造成重大损失。携带干扰片段的水稻品种如果证实具有一定的抗病毒性，必将对稳定这些稻区的种植面积，促进农业增效、农民增收，保护环境和实现农业可持续发展等具有极大的促进作用，推广应用前景广阔。