[00770833]海水养殖动物重要病原菌的蛋白组学研究

针对病原菌严重危害海水养殖动物等问题，该课题采用蛋白质组学等技术，从免疫原性、耐药和耐盐等方面开展了海水养殖动物重要病原菌的蛋白组学研究，并取得了重要进展。该课题于2002年正式启动，于2004年获得滚动支持，并于2005年11月通过了科技部组织的课题验收。微生物中和与交叉中和抗原的快速筛选与鉴定技术：以微生物为对象，采用免疫蛋白质组学技术，确定具有免疫原性和交叉免疫原性的蛋白质，再利用质谱技术和生物信息分析确定这些蛋白质的种类。进一步采用免疫攻毒方法，评价这些蛋白的中和作用。这一技术能够迅速确定具有中和保护作用的免疫原，达到高效、快速、经济、实用地优选保护性免疫原的目的。总之，该法一方面可以快速确定具有中和保护原性的位点，另一方面避免了基因克隆的盲目性，提高了制备高效疫苗靶点的效率。采用该技术对8种细菌的免疫交叉水平进行了评价，成功地筛选并鉴定了13个跨4-5种属的高度交叉免疫反应蛋白。结合体外抑菌试验，初步证明1个副溶血弧菌conservedhypotheticalprotein具有较强的中和原性。同时，应用免疫蛋白质组学的技术，从54个嗜水气单胞菌外膜蛋白中，发现8个具有免疫原性，并通过免疫和攻毒实验，证明其中3个具有较好保护原性，可望作为嗜水气单胞菌的疫苗候选成分。在这3个蛋白中2个具有明显的交叉保护原性，可作为单胞菌的多价疫苗靶位。盐调节蛋白OmpW和OmpV的研究：通过比较蛋白质组学技术，在国内外率先从副溶血弧菌及溶藻弧菌中发现和鉴定了一种类似于大肠杆菌双成分调控系统的调节机制，即OmpW和OmpV双成分调节蛋白，其中OmpW在高盐度下上调，而OmpV则在低盐度下高表达。同时，发现美人鱼发光杆菌亦表达OmpW和OmpV，是一对具有明显生物活性的盐调节蛋白，与细菌耐盐能力密切相关。通过基因过表达试验，证明这些细菌的Ompw和0mpV在大肠杆菌中诱导表达后，可以相应明显地提高其对盐的耐受力和敏感性。该功能还通过基因敲除得到确认。进一步以大肠杆菌K-12和嗜水气单胞菌为对照，研究了副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、非O1霍乱弧菌、弗尼斯弧菌、河弧菌、麦氏弧菌、创伤弧菌和美人鱼发光杆菌等细菌Ompw和OmpV的分布和表达规律。结果表明，Ompw和OmpV较普遍存在于弧菌中，与弧菌高盐耐受力有密切关系。细菌外膜耐药的蛋白质组：通过对多种抗生素耐药的蛋白质组进行系统比较，成功地在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中分别鉴定出9种和11种耐药相关蛋白质，其中7种是大肠杆菌对四环素和氨苄青霉素共同变化的蛋白质；5种是铜绿假单胞菌对四环素和氨苄青霉素共同变化的蛋白质；在这些耐药性相关蛋白中，3种是2种细菌所共有的。Ompw同时在不同细菌及不同药物的耐药株中出现表达差异，这表明它在细菌耐药机制中可能起到重要的作用。这种耐药性研究的方法和规模在国内外尚未见报道。该课题在国内发表论著3篇、国外16篇；申请发明专利7项、获得发明专利授权1项；获得海洋创新成果奖科技奖二等奖1项；培养博士后4名、博士6名、硕士10名。