[00353581]基因工程技术创制新型饲用植酸酶及纤维素酶

该项目受国家科技部、国家自然科学基金委、省科技厅和教育厅等12个课题的资助，研究共历时17年。针对饲用植酸酶和纤维素酶热稳定性欠佳和酶活不高的瓶颈问题，采用现代基因工程技术和高通量定向筛选技术平台，创制高热稳定性和高酶活性的突变体，不仅为饲用酶制剂的生产提供新酶种，也为饲用酶的改造、结构与功能研究提供理论基础。该项目共发表论文57篇(ScI收录7篇)，共被他引479篇次；获国家发明专利1项，申请5项；培养博士4名，硕士25名。主要成果如下：筛选获得了具有自主知识产权的植酸酶(酸性植酸酶、中性植酸酶)，纤维素酶(内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶)的天然高产酶菌株5株。克隆了植酸酶PHya基因，植酸酶PHyc基因，纤维素酶ENd、bGl和cbHb等基因。以上基因已在毕赤巴斯德酵母、巨大芽孢杆菌和大肠杆菌中实现了异源高效表达。该项目建立的真菌dNa提取及PcR技术体系已广泛应用于同类研究。建立了植酸酶和纤维素酶定点突变、结构延伸突变、易错PcR、dNa改组和结构域重构等现代基因工程技术平台，建立了植酸酶和纤维素酶高通量定向筛选技术平台。相应技术内容已申请或获得国家发明专利。研究结果对有效筛选获得具有热稳定性和高酶活性的突变体具有重要的指导价值。在国内外首次获得了植酸酶突变体(F43Y、I354M/l358F、I44E/t252R、Q172R、Q172R/K432R、Q368E/K432R和PHyaM-PHycS)，纤维素酶突变体(K91E、K369R和K91E/K369R)，显著提高了酶热稳定性和酶活性，或拓宽其PH作用范围。上述突变体的热稳定性和酶活性均达到和超过国内外报道水平，为饲用植酸酶和纤维素酶生产提供了新酶种。开展了酸性植酸酶毕赤酵母基因工程菌和内切葡聚糖酶巨大芽孢杆菌基因工程菌发酵工艺研究，发酵酶活为出发菌株产酶活性的921倍和48倍，试制了酸性植酸酶和内切葡聚糖酶酶制剂。试制的植酸酶产品已在饲料厂、猪场和鸡场进行了试验示范。该项目技术先进，结果可信，创新性突出，研究成果对于新型饲用植酸酶和纤维素酶的研发具有重要的理论和应用价值。成果整体水平达到国际同类研究先进水平。