本发明提供了一种提高L‑5‑甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法和和一种L‑5‑甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒及其构建方法和应用。本发明提供的L‑5‑甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)基因GlyA和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因MetF序列。本发明提供的提高L‑5‑甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法为,将L‑5‑甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L‑5‑甲基四氢叶酸原始菌株,获得重组菌并发酵该重组菌。最终发酵产物中,重组菌累积的L‑5‑甲基四氢叶酸显著高于原始菌株,提高了原料利用率,降低了生产成本和能耗。