[01920589]特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA及其应用
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所在地：内蒙古自治区呼和浩特市
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技术详细介绍
本发明提供了特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA和利用CRISPR/Cas9系统介导完成定点敲除以及定点整合EGFP基因的应用。本发明首先利用生物信息学方法预测出H11位点的完整序列(SEQIDNO.1),然后针对H11位点设计了两个sgRNA(SEQIDNO.2和3),转录所述sgRNA序列的DNA序列如SEQIDNO.4或5所示。构建了基于CRISPR/Cas9系统的打靶载体,然后利用TA克隆测序对sgRNA的引导效率进行验证,同时构建了同源整合EGFP基因载体,最后利用筛选出的sgRNA(Cas9/gRNA共表达载体)和同源整合载体(H11-EGFP)同时转染进绒山羊胎儿成纤维细胞,获得了H11位点定点整合EGFP基因的细胞株。本发明的sgRNA能特异识别绒山羊的H11位点,引导Cas9核酸内切酶对该位点进行高效切割,打靶效率在50％以上,能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象,进而减少因非特异性切割造成的非目标基因序列的突变。通过构建Cas9/gRNA表达载体可以在细胞、胚胎甚至是个体水平实现H11位点的特异性修饰(敲除或敲入),从而研究特定基因的表达情况,为新品种山羊的培育提供技术支持。