[01649378]超声激活声敏剂诱导肿瘤细胞凋亡和自噬机制研究

1.选题背景及意义 目前,肿瘤的临床治疗仍以手术、放化疗为主,但这些方法都难以根治肿瘤。因此,探索肿瘤治疗新方法是当前生物医学的研究热点和亟待解决的重大问题。声动力学疗法（SDT）利用超声对生物组织较强的穿透作用并聚焦于深层组织的肿瘤部位以激活肿瘤组织中特异性富集并长时间滞留的声敏剂,从而特异地杀伤肿瘤细胞,该方法表现出SDT独特的微创性、靶向性和安全性。 本项目以“国家自然科学基金”为依托,根据SDT抗癌涉及的多因素和复杂性,主要探讨SDT抗肿瘤的细胞分子生物学机制。从而为SDT这一具有广泛应用前景的肿瘤治疗新方法及早投入临床应用提供理论依据和实验资料。 2.主要论点与论据 ①比较了HpD、PpIX、Ce6等声敏剂在肿瘤细胞和正常细胞中的富集差异,发现声敏剂在肿瘤细胞中的累积量高出正常细胞6～18倍;声敏剂主要分布于肿瘤细胞的线粒体,提示线粒体可能是SDT作用的主要靶点。 ②采用MTT及克隆形成等方法分析了不同声敏剂剂量、超声强度及作用时间对肿瘤细胞的损伤效应,发现不同类型的肿瘤细胞应答声敏剂及超声的作用有所差异;研究筛选出对正常细胞基本无损伤而又能杀伤和诱导不同肿瘤细胞凋亡和自噬的SDT参数组合。 ③SDT诱导肿瘤细胞凋亡研究：通过TEM和SEM观察到SDT处理后肿瘤细胞凋亡的典型特征;Annexin V-PI染色显示SDT诱发的细胞凋亡呈时间依赖性变化,且可被Caspase抑制剂z-VAD-FMK所抑制;SDT处理后胞内Caspase-3活性增强、MMP下降、Bax/Bak转定位、细胞色素C释放等非常明显且可以被ROS清除剂NAC所抑制,提示ROS在SDT诱导肿瘤细胞线粒体-Caspase凋亡通路中起重要作用。 ④SDT诱导肿瘤细胞自噬研究：TEM观察到SDT处理后胞内出现大量自噬泡结构;Western blot检测LC3剪切、eGFP-LC3基因转染、AO染色、免疫荧光检测LC3和Lamp2共定位等实验证实SDT可以诱导细胞自噬发生,且其发生在SDT作用后的早期阶段。 ⑤SDT 诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的分子机制及互作关系研究：结合抑制剂实验及siRNA技术分析,发现SDT诱导自噬体的形成发生在凋亡的早期;抑制自噬增强了SDT诱导的线粒体-Caspase依赖性凋亡;而抑制凋亡的发生对SDT诱发的细胞自噬水平没有明显影响,提示自噬在SDT效应中起保护作用,可能与其清除受损线粒体阻止凋亡应答相关。SDT联合自噬抑制剂可以增强SDT抗肿瘤疗效。 3.创见与创新 ①追踪近年“自噬”在细胞生命活动调节中的“双重功能”研究热点,提出通过SDT引起肿瘤细胞自噬功能改变以提高其抗癌疗效的研究设想。通过优化SDT诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的理化参数组合,率先提出SDT诱导肿瘤细胞凋亡和自噬具有普遍性和细胞差异性。 ②首次研究了SDT触发肿瘤细胞自噬发生的理化因素、细胞器靶点、信号通路和基因调控路径,发现线粒体损伤和活性氧产生与细胞自噬功能改变密切相关。 ③采用多种特异性抑制剂阻断、siRNA技术研究SDT引发不同肿瘤细胞死亡模式及相互转换,重点探讨了不同SDT参数组合下凋亡与自噬的“协同或拮抗”作用,首次阐明了SDT处理后自噬与凋亡、细胞存活的关系。研究发现,筛选的对正常细胞无损伤但能触发肿瘤细胞凋亡和自噬的SDT临界参数阈值,联合自噬抑制剂的使用,能增强SDT抗肿瘤效应。其机制在于消除了自噬对凋亡的“拮抗”作用,强化了细胞的凋亡趋势。这对于降低SDT作用的理化参数阈值,更好地凸现SDT抗肿瘤的安全、靶向、无创优势具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。 ④建立了稳定可靠的离体研究系统和在体实验模型,项目研究过程中所研制的新型低频低强度聚焦超声装置,将为临床治疗仪器的开发提供有应用价值的设计原理、工艺方案和性能参数,从而为该疗法抗肿瘤的临床治疗和新型医疗装置研发积累了宝贵资料。 4.应用情况 研究成果先后在超声生物医学领域顶级杂志《Ultrasound in Medicine ＆ Biology》、《Ultrasonics Sonochemistry》等发表论文23篇,在国内核心期刊发表论文18篇,申请并获授权中国发明专利1项。课题组的研究对于SDT抗肿瘤作用机制提供了重要的理论和临床应用基础,尤其是首次发现的低强度超声激活声敏剂能引发肿瘤细胞自噬活性的提高,诱导肿瘤细胞凋亡现象,对探讨SDT抗肿瘤机制具有重要的创新意义。据不完全统计,截至目前,本研究成果所发表的23篇SCI论文,被Journal of Controlled Release、Cancer Letters等一流期刊上发表的论文他引157次,这充分表明本项目的研究工作处于国际前沿,获得的成果为国内外学者所认可。 5.获奖情况 荣获2014年陕西省高等学校科学技术奖一等奖。