[01559880]多杀菌素高产菌株选育及相关基因差异表达与基因功能分析

多杀菌素（Spinosad或Spinosyns）是来源于放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）的聚酮衍生大环内酯类生物杀虫剂。近年来,多杀菌素的生物合成备受关注,多杀菌素合成途径的调控仍然是研究热点。国内外研究人员采用阻断型载体阻断刺糖多孢菌磷酸甘露酶（PMM）表达、对菌株进行遗传改造或是优化培养基的手段使多杀菌素产量得到了不同幅度的提高。该项目采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术、多功能等离子体诱变系统（MPMS）与紫外线复合诱变手段,以浅蓝菌素、丙酸钠、磷酸二氢钾、2-脱氧-D-葡萄糖四种筛选剂为筛选方法,对诱变后菌株进行定向筛选,获得菌株5-35-19,其多杀菌素产量为441.86 μg/mL,较原始出发菌株产量增加了126.10%。本研究对传统诱变育种方法进行了新的探索和补充,证明了施加选择压力的理性筛选是比传统诱变方法更有针对性的筛选,能更有效地获得优良突变株。通过对比刺糖多孢菌野生型、高产突变株以及低产突变株的转录组差异,得到52个可能与多杀菌素产量相关的基因,其中上调基因28个,下调基因24个,并对其进行功能注释。构建了刺糖多孢菌质粒转化体系,通过对野生菌进行基因编辑,分别过表达上调基因wrbA和ACL73662,得到的突变菌株多杀菌素产量较出发菌株分别提高了69.0%和36.1%,敲除wrbA基因和ACL73662基因得到的突变菌的多杀菌素产量较出发菌株分别降低了53.6%和44.5%,证明wrbA、ACL73662基因正向调节多杀菌素积累。敲除下调基因CAM04663得到的突变菌的多杀菌素产量较出发菌株提高了23.4%,证明CAM04663基因负向调节多杀菌素积累。从而验证了3个差异表达基因对多杀菌素产量的影响。通过转录组技术筛选可能与多杀菌素合成相关的差异表达基因,为候选基因的挖掘和功能验证提供理论依据;建立了稳定的遗传转化系统,为基因编辑提供了平台;对野生菌进行基因编辑,探究目的基因对于多杀菌素产量的调节作用,研究结果对于了解目的基因的功能和构建高产的多杀菌素生产菌株等具有重要意义。