[01374963]海水养殖鱼类传染性虹彩病毒LAMP检测试剂盒的研发

本项目已完成ISKNV的LAMP-LFD检测最适条件、体系、引物组合、检测灵敏度和特异性的确定. LAMP-LFD 最适反应体系、反应条件及组合的确定。以标准品为模板，用LAMP引物组合分别进行LAMP方法进行优化，最终确定的生物素标记的LAMP反应为25μL体系，包含20 mmol/ L Tris-HCl (pH 8.8)，10 mmol/ L KCl，6.5 mmol/ L MgSO4，10 mmol/ L (NH4)2SO4，0.1% Triton x-100，0. 96 mmol/ L dNTPs，1. 6 μmol/ L FIP，1. 6 μmol/ L BIP，0. 2 μmol/ LF3，0. 2 μmol/ L B3，0. 4 μmol/ L LF，0. 4 μmol/ L LB，8 Ubst DNA聚合酶，1 μL DNA模板。阴性对照管不加DNA模板。反应混合物在63℃下温浴20min后，不终止反应，将 20 pmol 的探针FITC-HP加入反应体系中，63℃ 温育 5 min 杂交，取 8 μL 杂交液加入100 μL Buffer 混匀，将 LFD 试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。灵敏度分别是LAMP-AGE和PCR-AGE灵敏度的10倍和1000倍。选取5种水产养殖常见病原用于LAMP特异性验证，结果表明ISKNV呈阳性反应，而WSSV、LCDV、SVCV、IHNV和嗜水气单胞菌等均为阴性反应，空白对照双蒸水也无扩增。根据以上体系及反应条件，组装传染性脾肾坏死病毒LAMP-LFD检测试剂盒，并确定试剂盒的有效期限为一年。随机取样鱼类样品30份，仅在大黄鱼、石斑鱼、鳜鱼和黑鲷中检测到有ISKNV的侵染。LAMP-LFD检测试剂盒进行检测结果与凝胶电泳检测以及PCR检测结果一致。本项目研究相关结果已形成学术论文2篇，其中一篇SCI收录，另有一篇正式收录。申请相关技术发明专利3项。LAMP检测技术主要侧重人畜重大传染性疾病的快速检测技术研发，而针对水产养殖病原的检测研究刚处于起步阶段。到我们论文发表为止，国际水产领域仅有3篇论文报道了LAMP-LFD技术在虾病毒检测领域的应用，而在鱼类病毒病害检测应用中，ISKNV的LAMP-LFD检测技术是国际首次报道。该方法对设备的依赖性极小，检测速度快，操作简单，灵敏度高，结果直观，在病毒病害病原的检测和鉴定上将有较大的应用前景。 我国水产养殖病害引起的经济损失仅鱼类就高达百亿元/每年，其中病毒病害引起的损失有几十亿元/年，ISKNV的LAMP检测试剂盒的研发，将有效帮助养殖厂和养殖户们实地检控相关病毒病害的发生情况，提高扼杀病害于初期阶段的能力，减少损失，预计仅这一项至少可以挽回损失数亿万元/年，具有深远的社会效益。 目前，小批量试剂盒经过小范围推广试验，用户反馈良好。现已由宁波博奥生物工程有限公司进行大范围推广试用。