[01357091]家禽抗菌肽的分离纯化及其活性鉴定

本研究通过醋酸提取、CM-Sepharose F F弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）从固始鸡、丝毛乌骨鸡和鸵鸟异嗜白细胞中分离纯化出抗菌肽,应用二级质谱（MS/MS）对抗菌肽的分子量进行测定。使用微量琼脂糖弥散法进行了抗菌活性与最小抑菌浓度（MIC）的测定及鸵鸟抗菌肽的抗病毒试验。得到了如下主要技术性能指标： （1）建立完善了鸡和鸵鸟抗菌肽提取纯化和抑菌活性检测方法。 （2）固始鸡、乌鸡和鸵鸟中性粒细胞抗菌肽在80～130℃条件下加热处理30min仍保持良好的抗菌活性;而100℃加热不同的时间,其抑菌圈直径没有明显的变化,这表明活性成份不可能是溶菌酶等大分子蛋白质,而是分子量小、结构较简单的抗菌肽。 （3）使用醋酸提取、CM-Sepharose F F弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）从鸵鸟异嗜白细胞中分离纯化出抗菌肽,鸵鸟抗菌肽具有阳离子性质;热稳定性良好;SDS-PAGE凝胶电泳分析结果显示,其分子量在4700Da～4980Da之间。 （4）在鸵鸟中性粒细胞中存在天然抗菌物质,并表现出对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）、大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和真菌（白色念珠菌）较强的抑制作用。离子交换层析产物的抑菌试验结果表明,对金黄色葡萄球菌,真菌的抑制作用较大肠杆菌强。RP-HPLC纯化后抑菌试验结果表明,从得到的鸵鸟中性粒细胞抗菌肽显示出较强的抑菌活性。 （5）从固始鸡和乌鸡中提取得到抗菌肽,有较强的抗真菌和金黄色葡萄球菌的作用;固始鸡中性粒细胞抗菌肽对真菌的抑制作用要大于黄色葡萄球菌,而乌鸡中性粒细胞抗菌肽对真菌的抑制作用要小于黄色葡萄球菌。 （6）鸡胚接种的方法观察了鸵鸟中性粒细胞抗菌肽对新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒的灭活作用。将NDV与IBV与抗菌肽以不同的方法混合作用于10日龄的鸡胚,测定鸡胚尿囊液中NDV血凝效价,并观察鸡胚病变。结果发现,与攻毒组比较,鸵鸟中性粒细胞抗菌肽使鸡胚尿囊液中NDV血凝效价降低,同时还能抑制因上述两种病毒所引起的鸡胚病变。 （7）克隆了红羽丝毛乌骨鸡、固始鸡、崇仁麻鸡、固始鸭、固始鹅、鸵鸟、鸽等不同禽类β-防御素基因。构建了表达鸡β-防御素-4、β-防御素-11和β-防御素-12基因的大肠杆菌表达系统,研究了重组鸡β-防御素在大肠杆菌系统中高水平表达规律和蛋白纯化技术。登录了7条GenBank号,β-防御素-4基因：红羽丝毛乌鸡DQ673442、鸽子DQ860106、鸵鸟EF031035、固始鸭EF606702、固始鹅EF606703、β-防御素-11基因：固始鸡DQ997047、β-防御素- 12基因：固始鸡EF044309。