[01331005]重组人FLT-3配体基因工程酵母菌株的发酵培养与纯化

目的：在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人FLT-3配体，利用3.7L的发酵罐优化发酵条件，探索并建立其纯化工艺。

方法：KM71pPIC9K-FL工程菌接种于发酵罐高密度发酵，发酵上清经疏水层析和阳离子交换层析分离纯化，并对纯化样品进行N-端氨基酸序列测定和生物学活性的测定。

结果：KM71pPIC9K-FL工程菌采用3.7升发酵罐甲醇诱导补料批式发酵，最终确定含0.5%蛋白胨的FM21培养基，pH4.5，温度30℃，DO值在25～30%之间，在菌体密度达100(OD600)左右时诱导表达，补料方式为单纯甲醇补料，甲醇最终的流加速度在8.5～9ml/h/L初始发酵液体积，甲醇诱导72h，为较为适宜的发酵条件，rhFL在发酵液中含量可达230mg/L。

发酵上清经Phenly Sepharose 6 FF疏水层次和Q Sepharose HP阴离子交换层析连续分离获得了高纯度的rhFL，纯度达95%以上，回收率达60%左右。

rhFL的N-端测序结果表明其N-端5个氨基酸序列与标准FL完全一致。rhFL蛋白具有与天然蛋白FL相似的明显促进CD34+细胞的增生的生物学功能。

结论：建立了毕赤酵母表达rhFL的3升大规模发酵和纯化工艺，并证明此制备rhFL具有和标准FL一样的N-端序列和生物学活性。

该项目利用毕赤酵母表达体系获得高产量、高纯度的rhFL产品，其产量达230mg/L，高于目前国内外报道水平，通过优化发酵和纯化条件，探索出适合工业化生产的新工艺。

rhFL体外生物活性实验表明，毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL分泌表达的重组FL蛋白具有与天然蛋白FL相似的生物学功能。FL可以有效地促进体内树突状细胞、自然杀伤细胞、细胞毒T淋巴细胞的增殖、分化和成熟，从而在肿瘤免疫治疗中具有重要的应用价值，成为治疗肿瘤的新方法、新途径，会明显延长肿瘤病人的生存期。

在临床作为造血干/祖细胞体外扩增的辅助因子、造血干细胞动员剂和免疫佐剂，用于肿瘤的免疫治疗，具有广阔的临床应用前景。