[00129547]从人成纤维细胞样角膜缘干细胞生成胰腺激素表达细胞

技术摘要： 本技术涉及一种分离和表征成纤维细胞样角膜缘干细胞(f-LSC)的方法，和从f-LSC这种非胚胎干细胞获得胰腺β细胞的方法，以及涉及f-LSC用于治疗人类糖尿病的治疗用途。 技术创新性： 本技术提供了一种将成人f-LSC分化成能产生胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和生长素释放肽的胰腺β细胞的有效方案。 技术背景： I型糖尿病因自体免疫对胰腺β细胞的破坏而引起，导致胰腺β细胞几乎完全被杀灭。II型糖尿病在发病多年后，也出现胰腺β细胞物质减少的情况，最终也需要像I型糖尿病那样每日多次注射胰岛素来治疗。 目前补偿胰腺β细胞的损失的做法是移植整个胰腺或者分离的胰岛。但是由于人类器官供体缺乏，且需要长期免疫抑制治疗，这种方法具有很大的局限性。因此，人们正在寻求其他能产胰岛素的代用细胞。可以从胚胎组织、胎儿组织和成人组织分离得到的干细胞，是这种代用细胞的不竭来源。 人胚胎干细胞(ESC)拥有最广泛的分化潜能，理应是细胞替代疗法的最佳候选者。可是伦理问题是阻碍它们的应用的重要因素之一。胎儿（胎盘、羊膜、胚胎滋养层、脐带血）干细胞不存在伦理问题，但人们对它们向β细胞表型的分化转变潜能仍有争论。成人干细胞(ASC)在理论上优于胚胎干细胞和胎儿干细胞，但缺乏胚胎干细胞的多潜能性，在糖尿病领域也没有得到临床应用。 人角膜缘具有上皮干细胞群体，它们能不断再生角膜表面，以应对正常磨损（如眨眼）和修复损伤。角膜缘干细胞(LSC)位于角膜和结膜之间的过渡区域，据信是通过短暂扩增细胞(TAC)产生大量的功能性分化子代细胞，这些细胞最终向心迁移到角膜中央。 最近本技术人发现了人成纤维细胞样LSC (f-LSC)亚群的存在，这些细胞能表达几种多能性标志物，包括阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA4+)。它们具有自我再生特性和很快的增殖速度，似乎是优良的ASC候选者，可供进行基于干细胞的糖尿病替代疗法。 因此，本技术的目标是提供从ASC出发（尤其是从成纤维细胞样LSC 出发）产生胰腺激素表达细胞的方法。 f-LSC的优点 与ESC相比，f-LSC具有以下几个优点： 可以从自体供体或异源供体获得角膜缘样本 通过微创手术可获得角膜缘移植物。f-LSC可容易地从外植体培养并在体外扩增。 表面标记物可用于干细胞群体的快速纯化和富集 不存在II型HLA抗原 角膜缘细胞是免疫豁免的，可以躲过导致I型糖尿病的自体免疫机制，这使得有可能避免需要进行长期的免疫抑制治疗。 f-LSC能长期冷冻保藏 f-LSC的冷冻保藏可便于在疾病复发时重复使用，并可便于高通量临床研究和实验条件。 能够在体外分化成产胰岛素细胞 这使得f-LSC能用于治疗糖尿病。 f-LSC分化成β细胞结局的方法简单直接 能获得非常高比例的产胰岛素细胞（大约80%）。 能够制造出分化试剂盒，供用于专科实验室，也可用作常规技术。 f-LSC衍生的产胰岛素细胞在体外显示出葡萄糖响应性 与β细胞相似，f-LSC能够响应葡萄糖和其他刺激信号而分泌C肽。这一独特特征使得它们成为糖尿病治疗应用的潜在候选者。 技术应用： 成纤维细胞样角膜缘干细胞(f-LSC)的分离和表征； f-LSC分化成定形内胚层； f-LSC分化成胰腺上皮； f-LSC分化成胰腺内分泌细胞结局； f-LSC分化成产激素细胞； f-LSC分化成产胰岛素β细胞，供自体移植和同种异体移植； 体外测定法，供测试激素表达细胞的成熟和它们响应分泌刺激信号而分泌C肽的能力； 开发一组分化试剂盒。 未来计划： 在鼠动物模型中进行初步临床前研究 本技术人进行了来自角膜缘外植体的细胞的体外研究，目前正评估这种细胞在治疗患I型糖尿病的scid小鼠(NOD-scid)中的有效性。另外，本技术人将进行研究，以确定本技术是否能够实现在进行细胞的全身转移而又不出现免疫反应的情况下，胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和生长素释放肽得到长期表达以及具有治疗活性。如果是这样的话，本技术将成为再生医学的一项重要技术，可用于全身递送为免疫系统所接受的治疗性产胰岛素细胞。 潜在的技术受让方： 本技术人寻求有兴趣开发分化技术方案、从事临床前研究和临床研究并制造分化试剂盒的技术许可合作伙伴。