[01269048]转RgPAL1基因提高地黄中毛蕊花糖苷含量的方法

1课题来源：本发明经自筹资金。

2技术原理：本发明采用基因工程方法，从地黄中克隆基因苯丙氨酸解氨酶基因RgPAL1，构建含RgPAL1的植物表达载体，通过根癌农杆菌介导，将RgPAL1再次转入地黄使其过量表达，再生植株后，获得了毛蕊花糖苷含量显著提高的转基因地黄。

3技术创造性和先进性：地黄为玄参科地黄属多年生草本植物，具有清热凉血、调经、解毒之功效。地黄是中国传统的大宗中药材，据统计，它在中药处方中的使用频率排名位于前十。毛蕊花糖苷是地黄的主要药效物质，具有抗疲劳、抗氧化、延缓机体衰老等功效。《中华人民共和国药典》2010版一部地黄含量测定项下即规定，地黄中毛蕊花糖苷的含量不得低于0.020%。然而，由于中药药材中药效物质的含量主要由生产该中药药材的药用植物自身遗传基因型所决定，同时也受一定的生境条件影响，因而地黄药材中主要药效物质毛蕊花糖苷含量不仅不稳定，而且往往非道地药材中的含量远较道地药材中的含量低。为获得富含毛蕊花糖苷的药材，国内外科学家尝试了采用各种方法，这其中主要包括：（A）前体饲喂并优化多种多样的培养条件，（B）同位素标记以及（C）生化酶活三方面的研究。

如通过给盐生肉苁蓉Cistanche salsa的悬浮细胞外源添加苯丙氨酸、酪氨酸、咖啡酸、黄瓜汁，可增加毛蕊花糖苷的积累量;

给肉苁蓉Cistanche deserticola外源添加苯丙氨酸、椰子汁、酪蛋白水解物、脯氨酸也可不同程度提高苯乙醇苷的积累量;

给肉苁蓉悬浮细胞外源添加苯丙氨酸甚至可获得苯乙醇苷积累量提高75%的效果;

当给肉苁蓉悬浮细胞外源添加1.5 mmol·L-1苯丙氨酸时，苯乙醇苷可提高1.13倍。

在通过对欧丁香Syringa vulgaris和对橄榄Olea europaea同位素标记的研究后，国外学者一致认为苯丙氨酸能高效地参与毛蕊花糖苷咖啡酰基部分的生物合成。

而当用一种竞争性抑制剂氨基茚磷酸特异性抑制肉苁蓉悬浮细胞PAL的活性后，发现毛蕊花糖苷、松果菊苷等PeGs含量显著降低。

综上说明，苯丙氨酸是毛蕊花糖苷生物合成的一个代谢流分支点，PAL对毛蕊花糖苷的积累至关重要。

然而，虽然尝试了多种办法来提高中药药材中毛蕊花糖苷的含量，但到目前为止，通过前体饲喂来提高细胞培养系统中的毛蕊花糖苷含量尚不具商业前景。

在众多植物中，地黄叶中毛蕊花糖苷的含量最为丰富，因此，本发明以地黄为起始材料，通过基因工程的办法，向地黄中转入过量表达的RgPAL1，可显著提高地黄中的毛蕊花糖苷含量。该方法较以上提到的国内外方法简便快捷、成本更低、效果更好，可用于规模化生产毛蕊花糖苷。

技术的成熟程度，适用范围和安全性本发明筛选获得的毛蕊花糖苷含量提高的转基因植株，经反相高效液相色谱法定量分析比较后发现，转RgPAL1基因植株是非转化植株中的3.57倍。然而，由于转基因植株的生态安全性等多方面问题还不清楚，因此该技术仅适用于生物活性单体的生产。

应用情况及存在的问题目前尚处于实验室阶段，由于本发明可显著提高地黄中的毛蕊花糖苷含量且本方法国内外其他方法简便快捷、成本更低、效果更好，可用于规模化生产毛蕊花糖苷。但该转基因植株在继代过程中的遗传稳定性问题以及生态安全性问题仍不清楚。因此，有中药企业正与本单位密切合作，以进一步研究。

历年获奖情况无。