[01263052]基于单分子荧光成像技术的多糖大分子作用机制研究及在骨关节炎新药研发中的应用

山东省药学科学院科技成果“基于单分子荧光成像技术的多糖大分子作用机制研究及在骨关节炎新药研发中的应用”来源于山东省重点研发计划项目，项目编号2018GSF121033，起止时间自2018年1月至2020年1月。

应用领域：多糖等大分子药物药效和作用机制的研究，也可应用于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面。

技术原理：在体外，供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10 nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）;在体内，将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨的信息，来获得纳米级的成像。

性能指标：通过体外荧光共振技术原理证实hsp60蛋白是否是LWXG的作用靶点（相互作用距离为10 nm），通过体内单分子成像原理明确LWXG对纳米级细胞器互作的影响（定量研究范围在200 nm以下）。

主要的性能指标体现在：

（1）采用LWXG干预ACLT手术和细胞压力OA模型，发现LWXG可抑制软骨基质中胶原的丢失，保护软骨下骨小梁，减少软骨细胞凋亡，下调active caspase-9，active caspase-3和bax的表达，上调bcl-2的表达此外，LWXG可上调线粒体中cyt-c的表达，下调细胞质中cyt-c的表达。

（2）smFRET揭示LWXG与hsp60只能发生结合并不能发生能量共振转移，实现在单分子水平可视化研究多糖药物与蛋白的相互作用。

（3）超分辨显微成像（SIM）技术在纳米水平揭示LWXG对线粒体与溶酶体互作存在调控作用，可增加细胞自噬。

（4）该项目申请发明专利2项，授权发明专利1项，发表SCI论文5篇，培养“山东省有突出贡献中青年”人才1项，博士研究生1名，硕士研究生1名。

与国内外同类技术比较，技术的创造性与先进性：与国内外同类技术相比较，该技术首次建立了针对多糖类生物大分子的单分子荧光成像关键技术，制备了Hsp60-Cy3和LWXG-Cy5荧光体系并进行了表征，首次结合运用FRET技术和SIM技术对大分子多糖药物LWXG的药效和作用机制进行研究，该项目建立的单分子成像技术准确性高、可重复性强，可为类似药物研究提供思路技术的成熟程度，推广应用适用范围，应用情况和前景：

该技术从一个全新的角度阐述了大分子多糖类药物作用机制研究的新策略，相对于传统的技术手段，以LWXG为例证明了该技术在研究大分子药物与多糖相互作用的便捷性，准确性，成熟度高。本成果技术已应用于骨关节炎治疗药物LWXG的开发，并可推广应用至其他生物药物的研发。