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本课题是吉林省科技发展计划项目《利用生物技术快速繁育良种奶牛及防治乳房炎的研究》,课题编号:20070210。
目前,我省高产良种奶牛的数量有限,而奶业又快速发展时期,利用常规的繁殖技术(人工授精)进行改良时,遗传进展慢,所需世代长,按照牛自然繁殖速度繁殖奶牛,难以满足全省大力发展奶牛业的迫切需要。因此实用高效的胚胎工程技术是在我省畜牧业发展中具有广阔的需求。
胚胎工程技术是快速增加优质家畜数量和提高我省奶牛生产水平的需要,是解决从国外引进优质奶牛受限制的需要,是提高优质奶牛育种效率的有效方法。
本成果在技术层面主要贡献在于 (1)建立了新的奶牛高效胚胎体外生产体系; (2)建立了奶牛性别控制新方法; (3)研制出了人溶菌酶-抗菌肽基因工程制剂并用于奶牛乳房炎的治疗。
本项目以开发无化药残留、无抗生素残留和低耐药性的防治牛乳房炎的新型药物为目标,旨在提高奶牛产奶量和牛奶的品质和奶牛业的经济效益,是保证“好牛出好奶”的前提之一,对养殖业具有极其可观的市场前景,具有高效益,低风险的优势。
可见,本项目成果潜在的经济效益是巨大的,应用前景广阔。
本项目成果的应用,促进奶牛优质高产核心群的建立,加速良种奶牛繁育,对于推动奶牛小区建设、促进奶牛养殖业具有巨大的社会效益。
本项目从调控牛卵泡和早期胚胎发育的关键基因(Figla和神经营养因子家族)、精子基因表达及其功能和性别控制新方法、人溶菌酶-抗菌肽融合表达蛋白治疗奶牛乳房炎等三方面进了研究,在应用基础理论上和技术手段上均取得了重要创新性成果:
(一)Figla(生殖细胞特异表达的第一个转录因子)基因的研究有创新
1.首次克隆出牛Figla(生殖细胞特异表达的第一个转录因子)编码序列全长(登录在NCBI GenBANK,登录号EU581635),并证明:牛Figla基因完整CDS序列585bp,为含四个外显子的完整ORF区,此ORF区编码含有194个氨基酸的Figla成熟蛋白。
2.发现Figla在各个时期的牛卵母细胞和胚胎中表达水平都有极显著的差异。其中以GV期的卵母细胞的表达量最高,8细胞期表达量最低。Figla基因在牛IVF(体外受精)、PA(孤雌激活)和NT(核移植)囊胚中表达差异不显著。
(二)首次系统研究了神经营养因子家族在母牛生殖系统中的表达规律及作用
1.神经营养因子BDNF、NGF、NT-4/5及其受体在母牛黄体期和卵泡期生殖系统(卵巢、子宫、输卵管)中的表达具有差异性说明它们可能参与母牛生殖系统的发育和生长,并且影响繁殖周期。
2.NGF可以通过与其受体的结合影响输卵管上皮细胞对促卵泡素和促黄体素的分泌,同样,促卵泡素和促黄体素也可以影响输卵管上皮细胞对NGF和其受体的表达,说明NGF可以与一些生殖激素相互作用从而参与调节母牛的繁殖活动。
3.BDNF在各个时期的牛卵母细胞和胚胎中,4细胞期与桑椹胚期表达量差异显著,其它各期差异极显著。BDNF基因在IVF和PA之间表达差异显著,在NT囊胚中表达量显著低于IVF和PA囊胚。
4.建立了新的体外胚胎生产培养体系:在牛胚胎培养液中添加40μg/L的BDNF,可提高牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎的囊胚率;在牛胚胎培养液中添加10μg/L的NGF,可提高牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎的囊胚率;在DMEM中添加20μg/L的BDNF,可促进牛颗粒细胞的体外生长;在DMEM中添加5μg/L的NGF,可促进牛颗粒细胞的体外生长。
(三)精子基因表达及其功能、性别控制新方法的研究有突破
1.发现牛的成熟精子中表达BDNF、TrkB、TrkA的mRNA及其蛋白,并且它们的蛋白分别分布在精子不同的位置;牛的成熟精子可以自身分泌BDNF。BDNF和NGF可以通过与其受体的结合来影响精子胰岛素和瘦素的分泌,同时能影响精子的活力、线粒体活性、凋亡及精子内钙离子水平。
2.以人精子为模型研究发现,不育男性精子中BDNF、TrkA的mRNA显著低于正常生育男性的水平,同时不育男性精浆中BDNF浓度显著低于正常生育男性中的水平。这对于通过分子标记育种选择繁殖力高的种公牛有重要借鉴意义。
3.通过分子水平检测证明,SRY基因特异性地表达于Y精子。
据此,初步建立了基于SRY免疫的性别控制新方法,用SRY抗体处理牛精子后进行体外受精,所得胚胎雌性比率达75﹪以上。
(四)首次将人溶菌酶-抗菌肽tachyplesin融合蛋白用于奶牛乳房炎治疗,治愈率达92﹪。
本成果产生的过程中,培养了一批高素质的博士、硕士,为国家人才培养做出了贡献。
本成果发表了一系列高水平的研究论文,尤其是在国际著名刊物和国际会议发表的论文,以及国际会议上获奖的论文,均标注了吉林省科技发展计划项目资助,扩大了吉林省科技发展计划项目在国际上的影响。
本项目得到一系列理论上的创新成果和技术创新,有的填补国际空白,有点在国际上处于领先水平。这些成果丰富了动物生殖调控分子机理的理论,对于生殖生物学、动物繁殖学、养牛科学等学科的发展具有重要学术价值。
采用性别控制技术,使奶牛多生母犊,可快速增加良种奶牛数量的同时,也提高了牛群的质量,促进我国奶牛业向质量型的方向发展,具有明显的经济效益。
按我国奶牛存栏数1500万头计算,适繁母牛为55﹪即大约有825万头。繁殖成活率按80﹪计算,每年约繁殖660万头后代,正常母犊与公犊比例为1:1,每年增加330万头母犊。
采用性别控制技术,如果母犊率达到75﹪,则每年比正常多产165万头母犊,按每头母犊0.5万元计算,则每年增加经济效益82.5亿元。
如果母犊率提高到90﹪,则每年比正常多产264万头母犊,每年增加经济效益132亿元。
奶牛乳房炎是奶牛的多发病、常见病,仅临床型发病率就达30﹪左右。
那么按800万头产奶母牛计算,就有240万头临床型乳房炎母牛,采用本项目治疗方法,治愈率按90﹪计算,则治愈216万头,每头减少经济损失2000元,每年减少经济损失43.2亿元。
可见,本项目成果潜在的经济效益是巨大的。