[01209683]海藻多糖降解酶的制备技术及其应用

海藻多糖降解酶是具有自主知识产权的来源于海洋微生物的海洋工具酶，主要包括褐藻胶裂合酶酶、琼胶酶和卡拉胶酶。本项目阐明了海藻多糖降解酶的酶学性质，建立了酶的制备工艺和质量检测方法。海藻多糖降解酶不但本身具有重要的应用价值，而且可以作为工具酶用于制备活性海藻寡糖。一、海藻多糖降解酶的制备技术1．褐藻胶裂解酶：发现了4种藻胶裂合酶，建立了酶的制备工艺，其中2种酶的基因被克隆，并建立了重组酶的制备工艺。成果简介举例：从海洋弧菌QY101发酵上清液中分离了一种新褐藻多糖裂合酶，分子量39 kD，最适pH 7.5，最适温度30 ℃，降解褐藻胶的主产物3－7糖。该酶及其制备方法的优点：①发酵时间短，产量高，发酵液中杂蛋白含量少，酶的分离简单易行，直接采取膜分离浓缩和疏水层析，得到的酶制剂活力高，可直接应用，适合于工业化大规模生产；每升发酵上清液可获得约10万单位的酶。② 该酶温度稳定性好，在0℃保存1个月仍然能保证90％的酶活力，适合长时间运输与保藏；③ 在制备褐藻寡糖时，反应条件温和，作用时间短，产物专一性强，有利于寡糖的大量制备。研究进展：该酶的制备工艺和质量检测方法已建立。专利情况：已申请国家发明专利（专利号为03112325.2）。2．琼胶酶：发现了3种β-琼胶酶，并克隆了酶基因，建立了重组酶的制备工艺。成果简介举例：从海洋假别单胞菌CY24中发现一种结构和功能全新的?-琼胶酶AgaB，分子量为48.4 kD，在40℃和pH 6.3时酶活最高。AgaB与国际共享数据库中的已知基因完全没有同源性（包括琼胶酶基因），并且与迄今已报道的?-琼胶酶的性质不同，降解琼胶的主要终产物是新琼八糖和十糖，而迄今已知?-琼胶酶的主要终产物为新琼二糖、四糖或六糖，在国际上属于首次报道。目前已建立了产率高、成本低的酶制备工艺，每升发酵上清液可获得高纯度重组酶AgaB15.2万单位。研究进展：该酶的制备工艺和质量检测方法已建立。专利情况：已获得国家发明专利（专利号为ZL 03 1 12518.2）3．卡拉胶酶：发现了2种卡拉胶酶，初步建立酶的制备工艺。举例说明：最近，我们发现了一种结构和功能全新的λ-卡拉胶酶CglA，它来源于海洋Cellulophaga sp. QY201，分子量为38.0 kD，酶的最适温度30℃，最适pH7.5，降解λ-卡拉胶的主产物是四糖和六糖。目前已建立了酶的制备工艺，每升发酵上清液可获得高纯度重组酶AgaB9.6万单位。该研究成果正在申请国家发明专利。由于λ-卡拉胶寡糖含有多个硫酸基，可能具有更好的生物活性，因此，改酶的应用开发前景很好。二、海藻多糖降解酶的应用1．作为工具酶，用于制备活性海藻寡糖：海藻多糖降解酶特异性地降解海藻多糖，制备系列活性海洋寡糖。传统的海藻寡糖制备方法是稀酸水解法，该方法的工艺条件不易控制，并且裂解的产物分子量不均一，难以得到足量的寡糖纯品，且生产过程中产生大量的废气和废液，造成严重的环境污染。酶法降解底物的专一性强，工艺易于控制，有利于单一寡糖的制备，并且基本上无工业“三废”，属于绿色环保式现代生物生产技术，为海藻寡糖的应用开发研究创造了条件。2．在基础研究领域的应用：海藻多糖降解酶可用作海藻解壁酶。褐藻胶、琼胶、卡拉胶存在于褐藻、红藻的细胞壁，海藻多糖降解酶可以通过降解这些海藻多糖来制备原生质体，也有利于DNA、RNA和蛋白质的分离纯化，因此，在藻类生理生化、遗传学、分子生物学等基础研究领域具有重要应用价值。这些领域均属于当今生命科学研究的前沿和热点，因此，具有良好的的市场需求。3．在海藻养殖业的应用：海藻原生质体在藻类育苗育种、基因工程等应用研究领域有广阔的应用前景，特别是在高产、优质、抗逆新品种的培育方面意义重大。4．在农业领域：由于还在多糖降解酶可以降解一些病原微生物的胞外多糖，阻止病原微生物在农作物上的寄生，从而起到抗病害作用。5．在细菌生物膜感染的防治方面：随着现代微生物学研究的发展，人们发现在自然界、工业环境以及生物体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面，以生物膜（Biofilm）方式生长。生物膜无处不在，在很多方面给人类生活带来严重的影响，如细菌耐药、金属腐蚀、食品污染等。例如：铜绿假单胞菌（又称绿脓杆菌）是最常见的机会致病菌之一，容易形成细菌生物膜，引起细菌耐药，导致慢性感染；目前可供选择的抗菌药少、难以根治。铜绿假单胞菌生物膜的主要成分是胞外褐藻胶，褐藻胶裂解酶可降解胞外褐藻胶，恢复细菌对抗生素的敏感性，有望与抗生素联用治疗铜绿假单胞菌引起的慢性感染。