[01202840]氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成二羟基丙酮关键技术及应用

1. 任务来源： “十二五”国家科技重大专项“重大新药创制”课题“生物技术药物中试放大及分离纯化技术平台”子课题,项目编号：2012ZX09304009 2. 应用领域和技术原理 生物转化甘油生产二羟基丙酮属于工业生物技术应用领域,节能环保,符合国家中长期发展规划及产业发展政策。 图-1 静息细胞转化甘油生产二羟基丙酮模式图 氧化葡萄糖酸杆菌能够不完全氧化多羟基醇生成相应的醛或酸,负责底物脱氢氧化的酶位于细胞的周质空间,底物不需经过细胞膜进行细胞质就可以直接被氧化,即,底物及产物经自由扩散,大部分游离于细胞外反应液中,只有极少部分进入细胞继续被氧化。底物经脱氢酶氧化之后,电子传递模式如图-3所示,经泛醌,直接传递给末端氧化酶,经分子氧氧化生成水。在整个反应体系中,制约反应速率的因素,一个是甘油脱氢酶转化效率,另外一个是末端氧化酶反应速率,第三是氧气传输速率。本课题主要考虑甘油脱氢酶和氧气的因素。我们设计在氧化葡萄糖酸杆菌细胞内高表达甘油脱氢酶基因及辅助氧气摄入的血红蛋白基因,实现氧化葡萄糖酸杆菌高密度培养和细胞转化甘油生成二羟基丙酮能力的大幅度提高。 3. 性能指标 （1）通过基因工程技术,实现氧化葡萄糖酸杆菌高密度培养,使得细胞密度达8.5 g/L（干重）。 （2）通过基因工程改造,使得氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化甘油的时空效率提高到9.5 g/L?h,转化率达98%,产物浓度达133 g/L。 （3）经过优化分离工艺,二羟基丙酮的收率达67%左右,纯度达99%。 4. 与国内外同类技术比较 对国内外采用发酵或静息细胞转化技术生产二羟基丙酮进行技术比较,我们发现2005年德国Bauer等人开发的间歇补料发酵技术,使二羟基丙酮产物浓度达到160 g/L, 甘油转化率达95%,但时空产率仅为2.3 g/L?h。2007年还是德国研究人员Gatgens等人开发的补料发酵技术,使得二羟基丙酮产物浓度达176 g/L,甘油转化率达96%,但时空产率仅为2.2 g/L?h。国内郑裕国教授开发的新菌种经过补料发酵后,使得产物浓度达209 g/L,甘油转化率达96%,但时空产率仅为2.9 g/L?h。我们通过基因工程技术开发的氧化葡萄糖酸杆菌通过静息细胞催化转化甘油,产物浓度达133 g/L,甘油转化率达98%,时空产率达9.5 g/L?h,并且静息细胞可重复使用4个批次以上,由于甘油残留较少,容易通过结晶分离纯化产物,最终可获得99%纯度的二羟基丙酮,结晶收率达67%。综上所述,从生产成本、效率、和得率上进行比较,本项目开发的二羟基丙酮制备技术处于国内外领先水平。 5. 成果的创造性、先进性 （1） 利用透明颤菌血红蛋白提高氧化葡萄糖酸杆菌氧气的吸收具有创新性 在以往的文献或专利中,经常看到提高罐压、高速通氧气、或采用氧载体的形式提高反应液或发酵液中氧气的传输,利用透明颤菌血红蛋白提高氧化葡萄糖酸杆菌氧气的吸收,在这以前的文献中从没有报道过。 （2） 采用甘油脱氢酶基因与透明颤菌血红蛋白基因协调高表达,提高氧化葡萄糖酸杆菌生产二羟基丙酮的水平具有创新性 氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成二羟基丙酮的过程是一个系统工程,任何一个环节效率低下,就可能成为生产的瓶颈。本技术采用两者基因协调共高表达,使得细胞生产效率大幅度提高,这样的技术在以往文献或专利中没有发现。