[01177297]Exendin-4高产工程菌株选育及纯化工艺

糖尿病是一种世界性疾病，全世界糖尿病患者约2.5亿，我国2型糖尿病患者将近4000万，随着生活水平的提高，发病率将越来越高，且城市多于农村，由于患者须终生用药，因此我国治疗2型糖尿病药物的市场每年数百亿人民币。Exendin-4是一种含39个氨基酸残基的多肽，2005年在美国上市。临床实验表明，与其他治疗2－型糖尿病的药物相比，Exendin-4不仅副作用小，适合长期使用，而且性价比比其他药物更高，经济实惠，适合大多数人使用，因而Exendin-4作为一种治疗2型糖尿病的特效新药，在同类药物中具有极强的竟争力，具有广阔的市场前景。目前使用的Exendin-4均系化学合成，成本高，价格贵，本成果选育了Exendin-4高产工程菌株，探索了从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，为工业化生产具有自主产权的治疗糖尿病的特效新药――－Exendin-4奠定了基础。　　主要技术性能指标如下： 　　1、重组Exendin-4工程菌产量指标　　通过基因定向改造，选育了高产工程菌株BL21（DE3）plysS－Exendin-4。当菌液浓度达到OD600 =0.6时，1mmol/L IPTG在30℃、220rpm条件下诱导6h，重组Exendin-4达细菌蛋白质总量的约28.5%，且为可溶蛋白。　　2、Exendin-4最佳纯化工艺指标　　通过改进裂解液、洗脱液的配方及用量，优化了亲和层析工艺，使每克细菌生产6.44mg纯度 98%以上的重组Exendin-4，具体指标如下：　　　　裂解指标：裂解菌液透明，且裂解液中重组Exendin-4总量与裂解前一致。　　　　纯化指标：利用SDS－PAGE胶和软件分析鉴定亲和层析部分收集液的纯度，利用核酸检测仪鉴定含量。每克细菌可获得6.44mg纯度为98%的重组Exendin-4。　　　　切除N端融合蛋白指标： N端切除后留下含第1-39氨基酸残基的Exendin-4，在16%的Tricine-甘油-SDS-PAGE分离胶上有一条18kD的N端融合蛋白带和一条4.2kD的Exendin-4带，纯化后的Exendin-4在上述胶上只有一条4.2kD的带。通过纯化及肠激酶消化每克细菌可获得1.59mg天然结构的Exendin-4。　　3、Exendin-4的降糖活性指标　　　Exendin-4用量为0.17nmol/kg小鼠（0.7μg/kg）时，糖尿病小鼠（BKS.Cg-m +/+ Lepr db/J鼠）腹腔注射1h后血糖降低15.79%，4h后血糖降低达40.08%；Exendin-4用量为1.7nmol/kg时，注射后1h和4h血糖分别降低23.8%和51.93%，降糖效果优于美国Amylin公司化学合成的Exendin-4。　　4、产值指标　　利用该基因工程菌株，完全按照我们探索的表达条件和纯化工艺，5天可以完成一个工作流程。每升LB－AMP液体培养基可以生产7.14mg纯度99%的Exendin-4，根据市场平均价7000元/mg，产值达49980元/L菌液。100升的小型发酵工艺，每批产值可达499.8万元。去除消耗的化学试剂及水电等，利润约90%。　　因而，我们选育的Exendin-4高产工程菌株，探索的从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，为工业化生产具有自主产权、不受国外限制的Exendin-4奠定了基础。因此，尽快完成Exendin-4的中试，加快生产Exendin-4，使广大糖尿病患者吃得起药，看得好病，有利于构建和谐社会。综上所述，本项目具有一定的经济效益和社会效益，表现出广阔的应用前景。