[01161752]基于基因组尺度代谢网络分析的钝齿棒杆菌产精氨酸的分子育种研究

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）AS 1.542是我国研究者分离到的一株钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性菌,其已知序列与C. glutamicum的同源性高达99%且其突变株已广泛应用于多种氨基酸的生产,包括L-精氨酸（L-arginine, L-Arg）。L-Arg能促进各种免疫分子的合成从而可预防癌细胞的生长,促进尿液循环并降低血液中氨的含量;同时作为NO的前体,L-Arg还具有放松与扩张血管等功效。因此,L-Arg在医药和食品方面有广泛的应用价值,备受国内外研发和生产机构的关注。 本课题组通过随机突变的方式筛选到了一株精氨酸合成途径中负调控因子的编码基因argR发生了致死突变的钝齿棒杆菌菌株,在此基础上利用基因组尺度代谢网络模型分析了钝齿棒杆菌精氨酸的代谢流,获得了一系列可敲除或增加表达的基因,对这些基因所编码的蛋白的生理生化功能进行了分析后,采用无痕技术敲除了对细胞的生长影响不大、与精氨酸合成有竞争关系的支路的关键基因,包括合成脯氨酸的proB基因、合成乙酸途径的ack基因、运输谷氨酸到胞外的基因NCgl1221及合成脂肪酸的基因dtsR1基因等;采用同源重组技术在基因组中增加了运输精氨酸的蛋白的编码基因lysE。这些工作使精氨酸的产量从7.8mg/mL增加到了27.7mg/mL。本课题组通过外添加Tween 40,发现精氨酸的产量又进一步提升至约42mg/mL,这促使我们采用荧光定量PCR方法监控了二株工程菌（敲除了dtsR1和保留了dtsR1的菌株）中脱氢酶复合物（α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC;在三羧酸循环中,其催化α-酮戊二酸形成琥珀酰-CoA）的三个基因odhA、sucB和lpdA,磷酸戊糖途径的关键基因zwf的转录水平及精氨酸合成途径中的关键基因argB。结果发现,①在保留dtsR1的工程菌中odhA、sucB和lpdA的转录水平发生了显著的下调,且ODHC酶活的测定显示降低了25%,这有利于三羧酸循环途径的α-酮戊二酸流向谷氨酸并进一步流向精氨酸的合成途径,argB基因的转录水平相应显示上调;同时,zwf的转录水平发生了显著的上调,上调了约5.5倍,其上调为精氨酸的合成提供了更多的还原力,每合成1mol精氨酸要消耗3molNADPH,我们通过测试NADPH浓度及NADP+/NADPH的比值,证实Tween 40 的添加提高了NADPH的水平,这为精氨酸的合成提供了更多的辅助因子。以上结果显示,保留dtsR1基因时,Tween 40具有双重功效,既降低ODHC酶活又促进NADPH供应,从而提高了精氨酸的产量。②在敲除dtsR1的工程菌中,我们发现Tween 40的添加与不添加,odhA、sucB和lpdA的转录水平基本一致,ODHC酶活均降低了82.6%,表明dtsR1的敲除可以完全取代Tween 40的添加作用;但是zwf转录水平的提高与dtsR1基因不相关,完全是Tween的贡献;同时,argB基因的转录水平显示进一步上调。 综上所述,有关Tween 40对精氨酸产量的贡献的机理,我们将进一步通过转录组、蛋白组及代谢工程手段揭示并为构建高产精氨酸菌株提供理论基础。