[01161343]冬凌草素协同IL-18的抗肿瘤作用研究

一、课题来源与背景 本课题来源于浙江省自然科学基金,根据目前的流行病学调查发现,癌症是我国第一位致死性疾病,经典的肿瘤手术治疗模式,由于后期放、化疗等,致使病人多器官衰竭,中西医结合治疗成为现代肿瘤治疗的必然之路。生物抑癌制剂和中医药的有机结合,能发挥生物制剂有效调节机体免疫系统、促使机体免疫功能的提高,也能发挥中医药扶正祛邪、阴阳调和、全面调节体内环境和平衡,为人体对肿瘤的控制功能重新建立提供条件。 二、技术原理及性能指标 本研究通过细胞计数、MTT实验和DNA水平变化确定冬凌草甲素对不同肿瘤细胞发挥抑制作用的最佳浓度;应用基因表达谱芯片技术筛选可能发生变化的蛋白,并以此作为研究的基础;设计引物构建IL-18原核、真核表达载体,并通过ELISA试验观察胰腺癌细胞IL-18、IFN-γ和IL-2的表达;流式细胞仪检测细胞周期变化;ELISA法检测VEGF、bFGF的变化;设计引物从pGEM-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入p-EGFR-C1载体构建不同的突变子,转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平;此外,探讨了冬凌草甲素对胰腺癌BxPc-3 Cyclin D/Rb/p16,caspases、P53、Wnt等通路的影影响,加深对冬凌草甲素抑癌机制的理解。同时以中药薏苡仁油作用BxPC-3细胞后,经瑞士染色观察细胞形态,Hoechst33258荧光染色、DNA梯度电泳观察细胞凋亡等作为同类型不同通路的探讨。 三、技术的创造性与先进性 IL-18的多种生物学作用已经得到证实,而利用基因工程方法寻找适合的表达方式对IL-18来说是一个难题,本研究应用了载体构建的先进技术,通过设计引物进行了IL-18原核及真核表达载体的构建;设计引物从pGEM-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入p-EGFR-C1载体构建不同的突变子,转染原位胰腺癌BxPC-3细胞;通过引入淋巴细胞与肿瘤细胞共培养以尽量模仿肿瘤在体的微环境,对于带瘤生存状态的维持更加客观,这种方式在其他抗肿瘤研究中很少报道。 四、技术的成熟程度,适用范围和安全性 在研究中参与者熟练掌握了细胞计数、MTT实验、载体构建和细胞培养技术,并能应用于广泛领域,因本实验是体外细胞实验,故安全性高。 五、应用情况及存在的问题 肿瘤的治疗必然要走上中西医结合治疗的道路,冬凌草所具有的抗癌效果已经有大量的实验证实,但是目前对于冬凌草的开发还处于比较低级的阶段,本研究通过体外实验观察冬凌草甲素的对胰腺癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞的最低作用浓度,同时探讨了冬凌草甲素对上述细胞的DNA变化影响。 六、历年获奖情况： 通过本课题研究最终发表9篇文章：Sci文章1篇;一级期刊文章1篇;二级期刊5篇,三级期刊2篇;获得两个获奖证书。详细如下： 1.“Intracellular Movement and Interrelated Function of Human Interleukin-18 in the pancreatic cancer cell line BxPC-3 Cells”,Int.J.Med.Sci,2014:11（2）:172-179,Jin Yang,LinlinChen,BinXu,JianXu*,JinquanSun,WenShen,Ting Zhang 2.“薏苡仁油对人原位胰腺癌BxPC-3细胞生长及VEGF和bFGF表达的影响”,《中草药究》,2012,43（4）：724～728,许健,沈雯,孙金泉,吴晓莉,牟一平,李毅 3.“冬凌草甲素对胰腺癌细胞BxPC-3细胞Cyclin D/Rb/p16信号蛋白的影响研究”,《浙江中医药大学学报》,2013,37（5）：595-600,沈雯,许健*,孙金泉,牟一平,吴晓莉 4.“基于表达谱芯片的冬凌草甲素抑制胰腺癌BxPC-3细胞的机制研究”,《浙江中医药大学学报》,2013,37（5）：606～612,岳静,沈雯,许健*,牟一平,张婷,张斌 5.“五中重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达”,《科技通报》,2012,28（3）：68～74,孙金泉,许健*,沈雯,吴晓莉,牟一平,张婷,沃兴徳 6.“薏苡仁油对人胰腺癌BxPC-3细胞系影响白细胞介素18表达的体外实验研究”,《中医研究》,蔡琼,许健*,沃兴德,2010,23（7）：11～14 7.“IL-18-GPI融合蛋白的表达及其免疫增强作用的研究”,《科技通报》,2009,25（4）：445～450,许健,牟一平,樊拥军,许斌,吴晓莉,周云凯。 8.“冬凌草甲素联合IL-18抗肿瘤作用机制的研究进展”,《医学研究杂志》2011,40（2）：121～124,孙金权,许健* 9. D-环内酯水解酶基因钩取失败,撰写的综述“柠檬苦素类似物及其D环内酯酶研究进展”,《医学研究杂志》2010,39（4）：111～113,沈雯,许健* 本课题在研究过程中培养了研究生2名,本科生4名,其中参加浙江省第二届生命科学竞赛的本科生完成作品“EGFP融合hIL-18突变子在胞内的分布及其对胰腺癌 BxPC-3细胞IFN-γ,IL-2表达影响的研究”并在竞赛中荣获二等奖。论文“冬凌草甲素对胰腺癌细胞BxPC-3细胞Cyclin D/Rb/p16信号蛋白的影响研究”获得2013年浙江省中西医结合学会检验医学专业学术年会优秀论文奖。