[01109070]抗菌肽类似物NX-16的串联表达及应用

该项目为河南省科技创新杰出青年基金,项目编号：104100510028,应用领域为畜牧兽医领域或生物技术领域。 抗菌肽（antimicrobial peptides）是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽,也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。抗菌肽其抗菌活性高,抗菌谱广,种类多,可供选择的范围广,靶菌株不易产生抗性突变等原因,而被认为将在医药工业上有着广阔的前景。本研究将生物技术与抗菌肽的生产工艺相结合解决抗菌肽的来源问题,大大降低抗菌肽的生产时间和成本,为抗菌肽这一新型抗菌药物的开发奠定坚实的基础,为生产实践中所存在的药物残留等一系列问题提供必要的解决途径。本项目主要技术指标及性能如下： 1.抗菌肽的筛选和目的基因合成 利用生物信息学的方法,在NCBI上找出抗菌活性高、抗菌谱广和分子量小的含有13个氨基酸残基并具有线性结构的牛抗菌肽Indolicidin,在其N端加入激肽释放酶的氨基酸识别位点（PFR）,形成新的多肽,命名为LNK-16。人工合成LNK-16,经抗菌活性检测其仍具有活性,为串联表达产物的蛋白酶切打下基础。 2.原核表达载体的构建及诱导表达 把三个LNK-16进行串联,根据串联的氨基酸残基和大肠杆菌的偏爱密码子,反向翻译出它的基因片段。在片段两端加入EcoR I和Xho I两个限制性酶切位点和它们的保护碱基,形成总片段为178 bp的目的基因。利用SOEing-PCR设计引物的方法把目的基因片段设计成四段互补的重叠核苷酸序列,人工合成这四段序列,用TD-PCR方法扩增出目的基因,把目的基因和质粒载体pET-30a（+）进行双酶切,用T4 DNA连接酶构建出质粒载体pET-30a（+）-LNK-16,经过双酶切、PCR和核苷酸序列测定,结果表明载体构建成功。 3.蛋白质的纯化、酶切及活性检测 经优化实验,确定最佳诱导表达条件为终浓度500 μM的IPTG在37 ℃、pH7.2条件下诱导表达10 h。用SDS-PAGE对表达的蛋白进行检测,其表达量约占菌体总蛋白的32.6%,并且以包涵体的形式存在。用TrionX-100溶液清洗包涵体最后溶解在8mol/L的尿素中通过透析复性,然后在三乙醇胺缓冲液中用激肽释放酶酶切,酶解液总蛋白含量为0.307 mg/mL,其中LNK-16的理论含量约为1/2左右,用双层琼脂扩散法检测其抗菌活性,对大肠杆菌酶切1 h产物的抗菌活性最高,抑菌圈为1.06 cm,说明表达产物具有抗菌活性,从而为解决抗菌肽的来源问题提供了新的方法。 4.动物源性抗菌肽饲养肉猪和肉鸡的效果 本实验以杜大长三元杂交仔猪和AA肉仔鸡为实验动物,在饲料中添加不同剂量本实验室研发的新型抗菌肽或抗生素并设立对照组进行对比实验,为该动物源抗菌肽在临床运用提供科学依据。将表达出的LNK-16在肉猪上进行实验,结果显示以饲粮中添加0.5 %抗菌肽的饲喂效果最佳,健康水平最高。0.1 %抗菌肽的饲喂效果和猪健康水平与0.3 %阿莫西林相当,这说明抗菌肽能够很好地替代猪场常用的抗生素。将表达出的LNK-16在肉鸡上进行实验,结果显示在肉仔鸡日粮中添加4 mg/kg抗菌肽,能有效提高肉鸡成活率,改善饲料消化吸收,提高肉鸡的生产性能。 5.与国内外同类技术比较 血红蛋白抗菌肽由本课题组从牛红细胞血红蛋白中分离得到的一种由18个氨基酸残基组成的碱性蛋白多肽、已获得国家发明专利,设计的抗菌肽类似物NX-16已获得国家发明专利。 6.成果的创新性和先进性 本项研究成果通过一系列的试验对自主知识产权的抗菌肽进行表达、纯化以及应用研究。结果显示,该抗菌肽具有良好的应用前景,具有良好的生物安全性。经河南省农业科学院科技信息研究所查新表明,本研究成果在国内未见其他报道。因此本项研究成果在国内具有领先地位。